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Capitolo 1
Messaggi fra cellule e tessuti

Ciascuna cellula di un organismo multicellulare è programmata durante lo sviluppo a rispondere ad una specifica categoria di segnali che, interagendo in vario modo, ne regolano il comportamento e ne determinano la vita o la morte, la proliferazione o la quiescenza. Molti tipi di cellule producono messaggeri chimici o molecole-segnale, quali ormoni, neurotrasmettitori, derivati lipidici, fattori di crescita, citochine (Tab.1.1; Tab.1.2).

Alcuni di essi, come gli ormoni, sono riversati in circolo e interagiscono con tessuti bersaglio anche molto lontano (segnali endocrini); altri agiscono per diffusione locale su cellule vicine (segnali paracrini) o sulle stesse cellule che li hanno sintetizzati (segnali autocrini) (Fig.1.1).

Le vie di trasduzione richiedono sia molecole del segnale extracellulari sia un insieme complementare di recettori proteici che convertono il messaggio ricevuto in una serie di eventi biochimici intracellulari, generando l’effetto biologico. Quest’ultimo è correlato alla regolazione dell’attività funzionale e/o del numero di una varietà di proteine ed è la conseguenza di complicate interazioni fra molecole proteiche che coinvolgono spesso cascate di reazioni di fosforilazione catalizzate da proteine chinasi (Tab.1.4; Tab.1.5).

Esistono due tipi fondamentali di recettori per i messaggeri chimici: quelli intracellulari, tipici degli ormoni lipofili (come gli steroidei e i tiroidei) e quelli di membrana caratteristici di tutti gli altri segnali extracellulari, siano essi di natura peptidica o altro. Gli ormoni che agiscono tramite recettori nucleari regolano l’espressione di specifici geni e producono in genere i loro effetti primari in tempi più lunghi rispetto a quelli che agiscono tramite i recettori di membrana, anche se spesso questi ultimi innescano vie di segnalazione che possono propagarsi al nucleo, influenzando così anch’essi la sintesi ex novo di proteine. Esiste in realtà un intricato e complesso "dialogo crociato" fra le molteplici vie di segnalazione esistenti in una cellula, siano esse mediate da recettori nucleari o di membrana.

I recettori intracellulari per le molecole lipofile, che possono attraversare liberamente la membrana cellulare, sono presenti nel citosol o direttamente nel nucleo. In assenza di ormone, i recettori per gli ormoni steroidei sono presenti come monomeri associati ad alcune proteine dello shock termico (HSP). Il legame con l’ormone steroideo provoca la modificazione conformazionale del recettore che si dissocia dalle HSP e si lega ad un’altra molecola di recettore formando un omodimero (costituito cioè da due molecole identiche di recettore con l’ormone legato). Nel nucleo questo dimero si lega con alta affinità a specifiche seguenze di DNA situate in corrispondenza dei geni controllati dall'ormone e definite elementi di risposta all’ormone (HRE). Il risultato può essere l’attivazione trascrizionale con aumento della sintesi degli mRNA e quindi delle proteine codificate dai geni corrispondenti (Fig.1.3) o la repressione per una modulazione negativa della loro trascrizione. Agli effetti primari possono seguire alterazioni secondarie dell’attività o del numero di altre proteine o molecole con amplificazione della risposta cellulare. Esiste almeno un tipo di recettore (e un gene) per ciascuna classe di ormoni steroidei. Tutti questi recettori presentano caratteristiche strutturali e funzionali simili e vengono accomunati in un’unica superfamiglia di recettori di cui fanno parte anche i recettori per gli ormoni tiroidei (TR) (Fig.1.7), per la vitamina D (VDR), per l’acido trans-retinoico (RAR) e i recettori di attivatori della proliferazione perossisomiale (PPAR), che hanno la caratteristica di formare eterodimeri nucleari con il recettore RXR dell’acido 9-cis retinoico. Questi recettori non si associano alle HSP e possono interagire con gli HRE anche in assenza del ligando. Esistono inoltre numerosi recettori "orfani", cioè senza un ligando identificato. Nei recettori nucleari si possono identificare vari dominii, ciascuno con determinate proprietà strutturali e funzionali (Fig.1.4). In particolare il dominio E (o LBD, "ligand binding domain") fra le altre funzioni svolge quella di legare l'ormone. Il dominio C (o DBD, "DNA binding domain") ha invece la capacità di formare il legame specifico col DNA, a causa della presenza di due ripiegamenti della catena polipeptidica o Zn fingers, ciascuno contenente un atomo di Zn coordinato tetraedricamente a quattro residui di cisteina (Fig.1.5). Alcuni aminoacidi degli Zn fingers formano legami specifici con alcuni nucleotidi permettendo il riconoscimento dell’HRE. Gli HRE, localizzati spesso nella regione del promotore, hanno in genere le caratteristiche di elementi potenziatori (enhancer) e possiedono specifiche sequenze-consenso (Fig.1.6) di sei coppie di basi, ripetute con orientamento inverso (palindromi) o diretto (DR) e separate da un numero specifico di coppie di nucleotidi spaziatori. L’attivazione (o la repressione) trascrizionale è resa possibile dalla presenza di complessi proteici o "coregolatori" che mediano il reclutamento dei fattori di trascrizione di base e della RNA polimerasi e/o provocano una riorganizzazione della cromatina attraverso un’attività istone deacetilasi (corepressori) o istone acetilasi (coattivatori). I recettori nucleari possono essere attivati in alcuni contesti tramite fosforilazione ligando-indipendente, quindi anche in assenza dell’ormone.

I recettori di membrana per messaggeri solubili extracellulari sino ad ora identificati possono essere distinti in tre classi principali in base alle caratteristiche strutturali e al sistema di trasduzione (Tab.1.6).

Esse comprendono: a) recettori costituiti da proteine che formano canali ionici azionati dal legame con piccole molecole che funzionano da neurotrasmettitori; b) recettori in grado di attivare le proteine G eterotrimeriche, che svolgono la funzione di trasduttori modulando la concentrazione intracellulare di piccole molecole o ioni con funzioni di secondi messaggeri; c) recettori caratterizzati dalla presenza di polipeptidi con un solo dominio transmembrana, alcuni dei quali dotati di attività enzimatica, stimolata dal legame col ligando, altri privi di un’attività enzimatica intrinseca, ma in grado di reclutare proteine non-recettoriali e di innescare cascate enzimatiche. I recettori che interagiscono con le proteine G eterotrimeriche mediano l’azione di una varietà di messaggeri extracellulari, quali peptidi, proteine, amine, eicosanoidi, nucleotidi, ioni (Tab.1.7) e sono costituiti da polipeptidi con sette domini idrofobici transmembrana (Fig.1.8).

Il legame con l’agonista consente al recettore di attivare le proteine G eterotrimeriche (Fig.1.9), determinando lo scambio GDP/GTP nella subunità , la sua dissociazione dal complesso , e l’interazione con effettori, come canali ionici od enzimi (Tab.1.8), ad es. l’adenilato ciclasi (Tab.1.9) o la fosfolipasi C (Tab.1.10), che modulano la concentrazione intracellulare di secondi messaggeri (ad es. Ca, AMPc, DAG, inositoli fosfato).

Questi ultimi possono determinare l’attivazione di proteine chinasi, in grado di fosforilare proteine citoplasmatiche e/o nucleari (Fig.1.12; Fig.1.13), la liberazione di Ca dalle riserve intracellulari (Fig.1.13) o l’apertura di canali cationici. I secondi messaggeri possono interagire fra loro: il Ca, ad esempio, legandosi alla calmodulina, stimola l’enzima ossido nitrico (NO) sintasi che produce NO a partire dall’arginina. L’NO, che può essere prodotto anche dall’azione di citochine sulla forma inducibile dell’enzima, attiva la guanilato ciclasi solubile, con conseguente aumento della sintesi di GMPc, un altro secondo messaggero (Fig.1.16). Questo nucleotide può essere generato anche da una guanilato ciclasi di membrana, che è il recettore del peptide atriale natriuretico. Un gruppo eterogeneo di recettori presenta un solo dominio transmembrana. Alcuni sono dotati di attività enzimatica intrinseca tirosina chinasica, come i recettori per molti fattori di crescita (Fig.1.17) e per l'insulina (Fig.1.20), la cui attivazione porta alla stimolazione della proteina Ras e alla cascata di fosforilazioni delle MAP chinasi (Fig.1.18; Fig.1.19) o alla via di trasduzione della fosfoinositide 3-chinasi (Fig.1.21), che mediano prevalentemente segnali di proliferazione e sopravvivenza. Altri recettori, come quelli per l’ormone della crescita, citochine, interferone, eritropoietina, non possiedono attività enzimatica intrinseca, ma sono associati a tirosina chinasi citoplasmatiche o JAK (Fig.1.22), che fosforilano fattori di trascrizione (STAT), o proteine di altre vie di trasduzione, come ad esempio la via dell’insulina. Recettori privi di attività enzimatica, ma in grado di associare serine/treonine chinasi (IRAK) o altre proteine sono i recettori per l’interleuchina 1 e il TNF. Entrambi innescano vie del segnale che possono condurre all’attivazione della cascata delle MAPK e del fattore di trascrizione NF-kB (Fig.1.24), trasducendo prevalentemente segnali di sopravvivenza cellulare. La stimolazione del TNF-R1, tuttavia, può condurre all’attivazione della cascata delle caspasi e all’esecuzione della morte cellulare apoptotica (Fig.1.23). Altri recettori di membrana possiedono attività intrinseca serina/treonina chinasica: sono i recettori per il fattore di crescita trasformatore , per le activine e le proteine morfogenetiche dell’osso. Essi innescano la via delle SMAD (Fig.1.25), una famiglia di fattori di trascrizione che controlla la crescita, il differenziamento o l’apoptosi delle cellule bersaglio, attraverso la modulazione del ciclo cellulare.

La complessa rete delle vie di segnalazione esistente in una cellula costituisce un sistema integrato in grado di controllare accuratamente le decisioni della cellula di arrestare la crescita, differenziarsi, iniziare la morte cellulare programmata o progredire nel ciclo cellulare. Il ciclo cellulare è costituto da una serie altamente organizzata di eventi che porta la cellula a dividersi, producendo due cellule figlie con uguale patrimonio genetico. Una cellula destinata a crescere e dividersi passa attraverso una sequenza ordinata di fasi denominate: G1, S (in cui si ha replicazione di DNA), G2 e M (in cui avviene la mitosi). Un’altra fase, denominata G0 caratterizza lo stato di quiescenza, cioè lo stato in cui la cellula esce dal ciclo replicativo e può prepararsi al differenziamento. La maggior parte dei meccanismi biochimici che controlla la corretta progressione del ciclo cellulare regola due punti specifici o "checkpoints", cioè le fasi G1 e G2, periodi che precedono la duplicazione del materiale genetico e la mitosi. Il rientro delle cellule quiescenti nel ciclo replicativo, ossia la transizione G0/G1, è regolata da fattori mitogeni extracellulari che consentono la progressione del ciclo fino al "punto di restrizione in G1" (R), oltre il quale il ciclo può procedere senza necessità di stimoli esogeni. I mitogeni inducono nella cellula quiescente l’espressione di geni "della risposta precoce" che codificano fattori di trascrizione, come Fos e Myc, che, a loro volta, determinano l’espressione di "geni della risposta ritardata", per la sintesi di proteine che regolano il ciclo cellulare. Il sistema di controllo del ciclo cellulare a livello dei checkpoints G1 e G2, che può determinarne l’arresto per consentire eventuali riparazioni, è regolato dall’espressione ed interazione ciclica di proteine eterodimeriche, costituite da una subunità regolatrice o ciclina (CLN) e da una subunità catalitica, o chinasi ciclina dipendente (CdK) (Fig.1.26). L’attività delle CdK, dopo la formazione dei complessi con le CLN, è inibita da fosforilazione da parte di una proteina chinasi a doppia specificità: Wee 1. Nello stato di massima fosforilazione il complesso CdK-CLN è inattivo ed è mantenuto tale fino a quando una fosfatasi a doppia specificità, la Cdc25, non rimuove i residui fosforici. A loro volta, Wee 1 e Cdc25 sono diversamente modulate dal loro stato di fosforilazione: Wee 1 è attiva allo stato non fosforilato mentre Cdc 25 necessita di una reazione di fosforilazione. I complessi CdK-CLN regolano la progressione del ciclo cellulare fosforilando la proteina del retinoblastoma (RB), sequestrata nelle cellule quiescenti dal repressore HDAC, con rilascio del fattore di trascrizione E2F ad essa associato e conseguente attivazione dei geni necessari per la replicazione del DNA. L’attività delle CdK è regolata negativamente da una famiglia di proteine inibitrici o CKI, quali le p16, p15, p18 e p19, specifiche per le CdK4-6, e le proteine p21, p27 e p57, inibitori generali delle CdK, ma in particolare della CdK2, che controlla la transizione G1/S a valle del punto R. Numerosi stimoli, come il TGF-, il danneggiamento del DNA, l’inibizione da contatto e la senescenza replicativa inducono le CKI, determinando un blocco del ciclo a livello dei "checkpoints" (Fig.1.27). Importante modulatore di questi punti di controllo è la proteina p53, definita "guardiano del genoma" per il suo ruolo cruciale nelle decisioni della cellula di arrestare il ciclo, per consentire la riparazione di eventuali danni al DNA, o quando ciò non è possibile, promuovere la morte. Numerose vie di trasduzione del segnale regolano l’espressione, la stabilità e l’attività di proteine del ciclo cellulare, controllando il bilancio fra proliferazione e morte cellulare. L’apoptosi, la forma più frequente di morte cellulare programmata, è un meccanismo di eliminazione selettiva di cellule indesiderate, strettamente regolato a vari livelli, caratterizzato da alterazioni morfologiche tipiche quasi sempre mediate dall’attivazione della cascata delle caspasi (Fig.1.28). Questi enzimi sono cistein-proteasi, che si attivano proteoliticamente per azione di altre caspasi (Fig.1.29). Attualmente si conoscono due vie principali che possono trasdurre il segnale di morte: a) la via mitocondriale mediante la quale, in seguito a stimoli proapoptotici, sono rilasciati dal mitocondrio nel citosol alcuni fattori, come il citocromo c, che scatenano l’attivazione delle caspasi; b) la via recettoriale, legata all’esistenza di specifici recettori di morte appartenenti alla superfamiglia dei recettori del TNF, la cui attivazione può determinare, attraverso interazioni proteina-proteina, la cascata delle caspasi (Fig.1.30). L’azione di questi enzimi culmina con la digestione della proteina ICAD, con conseguente liberazione e traslocazione nel nucleo del CAD responsabile della frammentazione del DNA, importante marker del processo apoptotico (Fig.1.31). Esiste uno stretto rapporto fra ciclo cellulare e apoptosi. Quest’ultima è spesso associata ad una deregolazione dell’espressione e/o attività di proteine di controllo della transizione G1/S del ciclo, molte delle quali, come le CKI p21 e p27 e la proteina del RB nello stato defosforilato, sono substrato delle caspasi. Tuttavia, nelle cellule che non esprimono la proteina p53, una deregolazione del ciclo cellulare può condurre a trasformazione neoplastica.

 

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